نگهداری و بازسازی ستون اچ پی ال سی

استفاده بهینه از ستون‌های HPLC تأثیر زیادی بر طول عمر آن‌ها دارد. در این مقاله، نکات و دستورالعمل‌های مهم برای استفاده، تمیز کردن، نگهداری و بازسازی ستون‌های HPLC را بررسی خواهیم کرد.

دستورالعمل‌های عمومی برای نگهداری و بازسازی ستون HPLC

سیلیکا به عنوان یک پایه مناسب برای ستون‌های HPLC شناخته می‌شود. این ماده دارای پایداری مکانیکی بالا، خواص فیزیکوشیمیایی عالی، تنوع اتصالات و سازگاری با انواع حلال‌های آلی است. رعایت نکات زیر در استفاده از ستون‌های سیلیکا ضروری است.

 پایداری pH

به طور کلی، ستون‌های HPLC در محدوده pH بین ۲ تا ۸ پایدار هستند. پیش از مخلوط کردن ماده شوینده با حلال‌های آلی، باید pH اندازه‌گیری شود. برخی از ستون‌های پیشرفته‌تر می‌توانند حتی خارج از این محدوده نیز مورد استفاده قرار گیرند. با این حال، قبل از استفاده از ستون‌های سیلیکا در pH‌های غیرمجاز، حتماً دستورالعمل‌های تولیدکننده را مطالعه کنید. بهترین عملکرد ستون در محدوده pH بین ۲ تا ۶.۸ حاصل می‌شود.

فازهای ساکن بر پایه سیلیکا ژل خالص می‌توانند بسته به نوع اصلاح‌کننده‌های شیمیایی، تا pH حدود ۱۱ نیز مورد استفاده قرار گیرند. برای اصلاح‌کننده‌های بزرگ مانند پیرولیدین، استفاده در pH‌های بالاتر بلامانع است. اما در pH حدود ۸ و با اصلاح‌کننده‌های کوچک مانند آمونیاک، پیشنهاد می‌شود از فازهای ساکن بر پایه پلیمرها یا زیرکونیا دی‌اکسید استفاده کنید.

پایداری مکانیکی

فازهای ساکن سیلیکا از نظر مکانیکی بسیار پایدار هستند و می‌توانند در فشارهای بالای ۴۰ مگا پاسکال (۶۰۰۰ Psi) بدون مشکل استفاده شوند. با این حال، باید از شوک‌های ناگهانی فشاری اجتناب کرد، زیرا این شوک‌ها می‌توانند باعث ایجاد کانال‌هایی در داخل ستون شوند که منجر به شکافتگی در نوک پیک کروماتوگرام خواهد شد.

فاز متحرک یا شوینده

فازهای ساکن سیلیکا با تمامی حلال‌های آلی در pH‌های فوق سازگار هستند. استفاده از حلال‌های با کیفیت بالا و خلوص (HPLC grade) ضروری است و قبل از استفاده باید از فیلتر ۰.۵ میکرونی عبور داده شوند. حلال‌های ناخالص می‌توانند باعث جذب برگشت‌ناپذیر ناخالصی‌ها و انسداد مسیرهای جذب در طول ستون شوند که این امر می‌تواند به تغییر ماهیت ستون و ایجاد پیک‌های غیر واقعی منجر شود. بنابراین، قبل از هر گونه تزریق در شستشوی گرادیان، لازم است پیک‌های غیر واقعی شناسایی شوند. استفاده از پیش ستون مناسب و فیلترهای مسیر (in-line filter) نیز به افزایش عمر ستون کمک می‌کند.

نگهداری ستون‌های بلااستفاده

• برای نگهداری کوتاه‌مدت (مثلاً یک شب) : ستون را با آخرین شوینده استفاده شده شستشو دهید.
• برای نگهداری متوسط (دو روز آخر هفته) : ستون باید با آب خالص شستشو شود تا از رشد میکروارگانیسم‌ها جلوگیری شود.
• برای نگهداری طولانی‌مدت : ستون‌های سیلیکا باید در حلال آپروتیک نگهداری شوند و مقدار آب نباید بیش از ۵۰ درصد باشد. استونیتریل بهترین گزینه است.

احتیاط: قبل از شستشو ستون با استونیتریل، اطمینان حاصل کنید که بافرها به طور کامل شسته شده‌اند، زیرا نمک‌های بافر معمولاً در استونیتریل حل نمی‌شوند و می‌توانند باعث انسداد ستون شوند.

زمان تعادل ستون

زمان تعادل یک ستون به ابعاد آن بستگی دارد و به طور کلی، یک ستون پس از شستشو با حجمی معادل ۲۰ برابر حجم خود با شوینده به تعادل می‌رسد. در صورت افزایش سرعت جریان شوینده، زمان تعادل کوتاه‌تر می‌شود، اما ۱۰۰ درصد تعادل زمانی حاصل می‌شود که ستون با ۲۰ برابر حجم خود شستشو شده باشد.

نگهداری و بازسازی ستون HPLC

وجود ناخالصی‌های برگشت‌ناپذیر می‌تواند منجر به شکافتگی در نوک پیک کروماتوگرام شود. با این حال، می‌توان با استفاده از پروتکل‌های زیر نسبت به بازسازی ستون‌های آلوده اقدام کرد:

تعمیر ستون‌های فاز معکوس (RP)

• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با آب.
• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با استونیتریل.
• شستشو با ۵ برابر حجم ستون با ایزوپروپانول.
• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با هپتان.
• شستشو با ۵ برابر حجم ستون با ایزوپروپانول.
• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با استونیتریل.

نحوه بازسازی ستون‌های فاز نرمال (NP)

• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با هپتان.
• شستشو با ۵ برابر حجم ستون با ایزوپروپانول.
• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با استونیتریل.
• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با آب.
• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با استونیتریل.
• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با ایزوپروپانول.
• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با هپتان.

بازسازی ستون‌های تبادل یونی (Ion Exchange)

• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با شوینده قبلی به همراه بافر با غلظت دو برابر.
• تکرار مراحل شستشوی ستون‌های RP.
• شستشو با ۲۰ برابر حجم ستون با آب.
• تعادل دادن ستون به حالت اولیه.

ستون‌های بر پایه پلیمر

ستون‌های بر پایه پلیمر معمولاً سازگاری بیشتری با pH دارند، اما از نظر پایداری مکانیکی در مقایسه با ستون‌های سیلیکونی کمتر مقاوم هستند. این ستون‌ها با تمامی حلال‌های آلی سازگار نیستند و ممکن است در برخی حلال‌ها متورم یا منقبض شوند. بنابراین، برای نگهداری این ستون‌ها، باید به دستورالعمل‌های تولیدکننده توجه شود.

اگر در خصوص بازسازی و نگهداری ستون HPLC سوالی دارید، لطفاً با شماره های موجود در همین صفحه در تماس باشید. همکاران ما آماده پاسخگویی به شما هستند.