دستگاه HPLC

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography) که به اختصار HPLC نامیده می‌شود، یکی از پیشرفته‌ترین و پرکاربردترین تکنیک‌های آنالیزی در آزمایشگاه‌های مدرن محسوب می‌شود. این تکنیک بر پایه جداسازی اجزای مختلف یک مخلوط بر اساس برهمکنش‌های فیزیکی و شیمیایی بین فاز ساکن و فاز متحرک عمل می‌کند.

اصول بنیادی HPLC

سیستم HPLC از چندین جزء اصلی تشکیل شده است که در هماهنگی کامل با یکدیگر کار می‌کنند. پمپ‌های فشار بالا مسئول انتقال فاز متحرک با دقت بسیار بالا هستند و دبی جریان را در محدوده ۰.۱ تا ۱۰ میلی‌لیتر در دقیقه حفظ می‌کنند. سیستم تزریق نمونه که معمولاً از نوع لوپ‌های دقیق است، امکان وارد کردن حجم‌های مشخصی از نمونه را فراهم می‌سازد.

ستون‌های کروماتوگرافی قلب سیستم HPLC محسوب می‌شوند. این ستون‌ها معمولاً از جنس فولاد زنگ‌نزن ساخته شده و با ذرات سیلیکای اصلاح شده (فاز ساکن) پر شده‌اند. اندازه ذرات فاز ساکن معمولاً بین ۱.۷ تا ۵ میکرون متغیر است که رزولوشن جداسازی دارد.

مکانیسم جداسازی در HPLC

فرآیند جداسازی در HPLC بر اساس تفاوت در توزیع اجزای نمونه بین فاز متحرک و فاز ساکن صورت می‌گیرد. هر چه برهمکنش یک جزء با فاز ساکن قوی‌تر باشد، زمان ماند بیشتری در ستون خواهد داشت. این پدیده با معادله اصلی کروماتوگرافی توصیف می‌شود.

k = (tR – t0) / t0

که در آن k فاکتور ظرفیت، tR زمان ماند و t0 زمان مرده است.

 اجزای اصلی دستگاه HPLC

سیستم پمپاژ : پمپ‌های مدرن HPLC قادر به تولید فشارهای تا ۱۵۰۰ بار هستند و از انواع مختلفی شامل:

• پمپ‌های پیستونی متقابل
• پمپ‌های دیافراگمی
• پمپ‌های سینریژ

سیستم تزریق نمونه : انژکتورهای خودکار مدرن قادر به تزریق حجم‌های دقیق در محدوده ۰.۱ تا ۱۰۰ میکرولیتر با دقت قابل توجه هستند.

انواع دتکتورها

• دتکتور UV-Vis : پرکاربردترین نوع، حساسیت تا ng
• دتکتور فلورسانس : حساسیت بسیار بالا تا pg
• دتکتور refractive index : برای ترکیبات فاقد کروموفور
• دتکتور MS : برای شناسایی ساختمان مولکولی

کاربردهای گسترده HPLC

صنایع داروسازی : HPLC نقش حیاتی در کنترل کیفیت داروها، تعیین خلوص، آنالیز فرآورده‌های دارویی و مطالعات پایداری دارد. مطابق با استانداردهای USP و ICH، از HPLC برای تعیین محتوای دارو، شناسایی ناخالصی‌ها و تست انحلال استفاده می‌شود.

صنایع غذایی و آشامیدنی ( تعیین افزودنی‌های غذایی – اندازه گیری ویتامین‌ها – شناسایی باقیمانده آفت‌کش‌ها – کنترل کیفیت محصولات نهایی)

علوم زیستی و پزشکی ( آنالیز متابولیت‌ها در نمونه‌های بیولوژیکی – مطالعات فارماکوکینتیک – تشخیص بیماری‌ها از طریق بیومارکرها)

محیط زیست (پایش آلاینده‌های آلی- اندازه گیری فلزات سنگین- آنالیز پساب‌های صنعتی)

 مزایای HPLC نسبت به تکنیک‌های مشابه

• رزولوشن بالا : HPLC قادر به جداسازی ترکیبات با ساختار شیمیایی بسیار مشابه است. استفاده از ستون‌های با ذرات ریز (کمتر از ۲ میکرون) و سیستم‌های UHPLC امکان دستیابی به رزولوشن بی‌نظیری را فراهم می‌کند.
• حساسیت قابل توجه : دتکتورهای مدرن HPLC قادر به شناسایی مقادیر بسیار کم (تا حد پیکوگرم) از آنالیت هستند. این ویژگی در آنالیز نمونه‌های بیولوژیکی و مطالعات trace analysis حیاتی است.
• دقت و صحت : سیستم‌های کمی‌سازی در HPLC از دقت بسیار بالایی (معمولاً RSD < 2%) برخوردارند که برای آنالیزهای کنترل کیفی ضروری است.
• اتوماسیون کامل : دستگاه مدرن HPLC قابلیت کارکرد ۲۴ ساعته و پردازش همزمان چندین نمونه را دارا هستند.
•  تفسیر کروماتوگرام : خواندن و تفسیر صحیح کروماتوگرام نیاز به درک پارامترهای کلیدی دارد:

پارامترهای کلیدی

زمان ماند (Retention Time) : شاخص کیفی برای شناسایی ترکیبات
مساحت پیک (Peak Area) : پایه کمی‌سازی
عرض پیک (Peak Width) : شاخص کارایی ستون
فاکتور ظرفیت (Capacity Factor) : معیار قدرت جداسازی

فاکتورهای موثر بر جداسازی

• ترکیب فاز متحرک
• pH محیط
• دمای ستون
• گرادیان حلال
• نوع فاز ساکن

توسعه روش در HPLC

بهینه‌سازی پارامترها : توسعه یک روش HPLC بهینه نیاز به بررسی سیستماتیک پارامترهای مختلف دارد:  انتخاب فاز متحرک مناسب – بهینه‌سازی گرادیان – تنظیم دمای ستون – انتخاب دتکتور مناسب

اعتبارسنجی روش : روش‌های HPLC باید مطابق با دستورالعمل‌های ICH اعتبارسنجی شوند که شامل: خطی بودن – دقت – صحت – حد تشخیص و تعیین مقدار – Robustness

 نگهداری پیشگیرانه

• تعویض منظم فیلترها
• شستشوی دوره‌ی ستون
• کالیبراسیون منظم سیستم
• کنترل فشار و نشت‌یابی

 عیب‌یابی رایج

• پیک‌های پهن : نشانه فرسودگی ستون
• فشار بالا : انسداد در سیستم
• نویز پایه : آلودگی دتکتور
• تغییر زمان ماند : نوسانات دما یا ترکیب فاز متحرک

چشم‌اندازهای آینده

UHPLC : کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق العاده بالا (UHPLC) با استفاده از ذرات زیر ۲ میکرون و فشارهای تا ۱۵۰۰ بار، سرعت و حساسیت را به طور قابل توجهی افزایش داده است.

LC-MS/MS : تلفیق HPLC با طیف‌سنج جرمی tandem، امکان شناسایی دقیق ساختمان مولکولی و با حساسیت بسیار بالا را فراهم کرده است.

Miniaturization : سیستم‌های micro-LC و nano-LC برای آنالیز نمونه‌های با حجم بسیار کم توسعه یافته‌اند.